Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
2.7.13. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АНТИ-D-ИММУНОГЛОБУЛИНА
МЕТОД А
Активность человеческого анти^-иммуноглобулина определяют путем сравнения количества препарата, необходимого для агглютинации D-положительных эритроцитов с количеством препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, необходимым для получения того же эффекта.
За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандартного Образца. Эквивалентность Международного Стандартного Образца в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Стандартный образец человеческого анти^-иммуноглобулина BRP калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом и предназначен для использования в количественных определениях человеческого анти^-иммуноглобулина.
Используют пул D-положительных эритроцитов, собранных не более чем за 7 дней до испытания, хранившихся соответствующим образом и полученных не менее чем от четырех групп доноров с группой 0 R1R1. К подходящему объему клеток, предварительно трижды промытых раствором натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, добавляют равный объем раствора бромелайна R, выдерживают при 370С в течение 10 минут, центрифугируют, отделяют супернатант и промывают трижды раствором натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. 20 объемов эритроцитов суспендируют в смеси 15 объемов инертной сыворотки, 20 объемов раствора бычьего альбумина R концентрацией 300 г/л и 45 объемов раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. Полученную суспензию охлаждают ледяной водой при постоянном перемешивании.
С использованием калиброванного автоматического прибора для разведения и раствора для разведений, содержащего 5 г/л бычьего альбумина R и 9 г/л натрия хлорида R, готовят подходящие разведения испытуемого препарата и препарата сравнения.
Определение обычно проводят по изложенной ниже методике, используя соответствующий прибор для непрерывного автоматического гемолитического анализа. Температуру в трубопроводе, кроме инкубационных ячеек, поддерживают на уровне 15,00С. Вводят с помощью насоса в трубопровод аппарата суспензию эритроцитов со скоростью 0,1 мл/мин и раствор метилцеллюлозы 450 R концентрацией 3 г/л со скоростью 0,05 мл/мин. В течение 2 минут со скоростью 0,1 мл/мин вводят разведения испытуемого препарата и препарата сравнения. Перед введением очередного разведения вводят в течение 4 минут со скоростью 0,1 мл/мин раствор для разведений.
Вводят воздух со скоростью 0,6 мл/мин. Инкубируют при 370С в течение 18 минут, после чего рассеивают столбики эритроцитов путем введения со скоростью
1,6 мл/мин раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, содержащего подходящий увлажняющий агент (например, полисорбат 20 R в окончательной концентрации 0,2 г/л) для предотвращения разрушения аппликаций. После оседания агглютинатов дважды декантируют: вначале со скоростью 0,4 мл/мин, затем - со скоростью 0,6 мл/мин. Эритроциты, не подвергшиеся агглютинации, лизируют
раствором, содержащим 5 г/л октоксинола 10 R, 0,2 г/л калия феррицианида R, 1 г/л натрия гидрокарбоната R и 0,05 г/л калия цианида R и подаваемым со скоростью 2,5 мл/мин. Система включает петлю для получения десятиминутной задержки, необходимой для конверсии гемоглобина. Оптическую плотность (2.2.25) гемолизата регистрируют непрерывно при длине волны, выбранной в интервале от 540 до 550 нм. Определяют диапазон концентраций антител, на протяжении которого существует линейная зависимость между концентрацией и полученным изменением оптической плотности (ДА). Исходя из полученных результатов, строят градуировочную кривую, участок линейности которой используют для определения активности испытуемого препарата.
Активность испытуемого препарата вычисляют с использованием обычных статистических методов (5.3).
МЕТОД В
Активность человеческого анти-й-иммуноглобулина определяют методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа, производимого на титрационных микропланшетах, покрытых эритроцитами. Метод основан на конкурентном связывании между поликлональным препаратом анти-й-иммуноглобулина и биотинированными моноклональными анти-й-антителами, направленными против специфического эпитопа й-антигена. Активность испытуемого препарата сравнивают с препаратом сравнения, калиброванным в Международных Единицах.
За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандартного Образца. Эквивалентность Международного Стандартного Образца в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Стандартный образец человеческого анти^-иммуноглобулина BRP калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом и предназначен для использования в количественных определениях человеческого анти-й-иммуноглобулина.
МАТЕРИАЛЫ
Реагенты, для которых нет особых указаний, должны быть аналитической степени чистоты.
СФБ (раствор хлорида натрия в фосфатном буфере). 8,0 г натрия хлорида R, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата R, 0,2 г калия хлорида R, 0,2 г калия дигидрофосфата R и 0,2 г натрия азида R растворяют в воде R и разбавляют до 1000 мл тем же растворителем.
